Informe – Sección I: Diseño de herramientas CRISPR-Cas9
Informe – Sección I: Diseño de herramientas CRISPR-Cas9
Usted desea generar un knock-out del gen BAX humano con el objetivo de evaluar su impacto en el funcionamiento de células de la línea DU145. Para ello, se propone diseñar un sistema de edición basado en CRISPR-Cas9 utilizando la nucleasa SaCas9, incluyendo el diseño de sgRNAs y un oligonucleótido donor para dirigir la reparación mediante Homology Directed Repair (HDR).
Responda las siguientes consignas de forma clara y fundamentada. Se valorará la claridad conceptual, capacidad de integración, la correcta justificación de las decisiones de diseño y el uso adecuado de conceptos. Extensión sugerida: máximo 2–3 páginas.
1. Diseño y análisis del sgRNA
A partir de un sgRNA seleccionado para el gen BAX, describa sus características principales. Indique:
· la región del gen a la que se dirige
· la ubicación del sitio de corte esperado
· la secuencia PAM asociada
· posibles sitios off-target y su potencial impacto funcional
2. Diseño del molde para transcripción in vitro (IVT)
Considerando que el sgRNA será sintetizado mediante IVT, diseñe esquemáticamente el molde de ADN necesario. Diseñe los oligonucleótidos de ADN solapantes necesarios para generar el molde para la IVT. Indique ambas secuencias en dirección 5’→3’ e indique en su diseño:
- la ubicación del promotor T7
- la secuencia guía
- la secuencia scaffold
Explique por qué es necesario incluir un promotor T7 en el diseño del molde de ADN.
3. Diseño de un donor para edición dirigida (HDR)
Diseñe conceptualmente un oligonucleótido donor para introducir una mutación de pérdida de función en el gen BAX. Indique:
- la ubicación de los brazos de homología
- el tamaño relativo esperado de los mismos
- su posición respecto al sitio de corte generado por Cas9
Explique por qué es necesario modificar la secuencia PAM o la región reconocida por el sgRNA en el donor.
4. Evaluación de especificidad del sistema
Usted ha diseñado un sgRNA eficiente para el gen BAX, pero existen posibles sitios off-target. Proponga al menos dos estrategias experimentales para evaluar la ocurrencia de eventos de edición fuera del sitio blanco.